【合議組】
參加口頭審理的雙方當事人及代理人到庭，書記員核實到庭人員的身份。

【合議組】
合議組就座。書記員宣讀口頭審理審議庭規則。
合議組組長宣布口頭審理開始。
根據專利法第46條的規定，對專利號為200780037776.9，名稱為“具有改變性質的葡糖淀粉酶變體”的4W107233的發明專利權無效宣告請求案的口頭審理，現在開始。 ;
合議組成員
組長：鄒凱
主審員：魏聰
參審員：葛永奇、王榮霞、史晶
書記員：關梅君、楊瑩躍 ;

【合議組】：審議庭調查開始，請請求人簡述無效的理由和事實。
【請求人】：
（1）權利要求1-2對應的說明書公開不充分，不符合專利法第26條第3款的規定。
（2）權利要求1-2不符合專利法第22條第3款的規定。依據的證據：證據1-6。
（3）權利要求1-2不符合專利法第26條第4款的規定。
（4）權利要求1-2不符合專利法第33條的規定。
（5）權利要求1-2不符合專利法實施細則第20條第1款的規定。

【合議組】：由于該案無效理由涉及多個法律條款，合議組在前期已經進行了第一次口頭審理，今天的口審是第二次口審。在第一次口審過程中，合議組對雙方當事人的收轉文情況進行了核實、對雙方提交的證據進行了質證，對質證意見均無異議，對涉及專利法第33條、第26條第3、4款的部分理由以及專利法實施細則第20條第1款的無效理由進行了調查，今天的口審將在前次口審的基礎上，主要對部分不符合專利法第26條第3、4款的理由，前期還未進行審理的專利法第22條第3款的無效理由進行實體調查。
【請求人】：無意見。
【專利權人】：無意見。

【合議組】：請專利權人陳述本專利的技術方案。
【專利權人】：本專利首次揭示了向親本里氏木霉葡糖淀粉酶（TrGA）中引入I43F/R/D/Y取代，首次獲得改善其比活和/或熱穩定性，具體序列為序列1-3。

【合議組】：調查關于實驗數據能否證明相應技術效果，歸納請求人認為本專利不符合專利法第26條第3、4款規定的理由如下：
（1）關于熱穩定性，本專利采用性能指數PI，即（變體殘留活性）/（親本酶殘留活性）表征，然而在所采用的測定條件下親本酶殘留活性的離散度很大（相差約3倍），由于說明書沒有提供原始數據和統計分析方法，故本領域技術人員無法確認二者之間是否存在顯著差異，因此PI值的獲得具有較大偶然性，即說明書并未充分公開足以確認變體確實帶來熱穩定性改善。
（2）同理，比活性測定也存在如上問題。
基于以上，說明書公開不充分，不符合專利法第26條第3款的規定。
請求人是否認可，有無補充。
【請求人】：認可。補充：PI值的數據來源和計算方法有問題，計算PI值所依據的基礎是未經純化的上清液，是存在大量的雜蛋白的混合液，參考文獻6-7證明雜蛋白的表達量和目標蛋白含量差距不大，會影響總體的酶量，因此測定數值是不準確的。親本殘留活性置信區間波動過大，無法確定突變體的變化是否是由實驗誤差帶來。反證4沒有提供日常變動的幅度，反證5的實施例6-10的實驗條件不同，并非日常變動的條件，且其差別也僅有1.6倍，也遠小于本專利中的相差3倍。懷疑是否能證明變體的熱穩定性和比活性是否得到改善，需給出原始數據，統計學方法和結果等。

【合議組】：請專利權人針對上述理由陳述意見。
【專利權人】：PI是二者的商值，大于1表示具有改善的比活和熱穩定性，本專利說明書已公開了各種變體的PI值，以及具體的測定方法，本專利說明書公開是充分的。
請求人補充的涉及上清液作為基礎影響PI值的準確性的理由是新增的，不接受；參考文獻1-7的提出超出了舉證期限，不接受。即使考慮上述新增理由，請求人也沒有提供證據證明其觀點。粗蛋白或粗制液作為基礎驗證酶的性能也是本領域常見的方法。且對于重組表達目的蛋白而言，目的蛋白的含量也占絕大多數。親本酶所出現的活性的變動屬于日常波動，如證據3、5，以及反證5的實施例6可以證明，酶學領域是將待測酶樣與對照酶樣在同一批次同時檢測，是本領域的公知常識，本專利也是將親本酶和變體酶在同一批次測量，使得無關變量的影響被平衡和抵消，因此本專利PI值能夠反映性能的改善。
關于實驗的重復性驗證、具體設計、統計學方法，這是本領域的常規技術，無需對每個實驗細節都進行描述。

【合議組】：參考資料1-7是作為參考還是證據使用？
【請求人】：僅作為參考。

【合議組】：調查關于專利法第26條4款的理由。歸納無效理由：對于涉及序列3的技術方案：序列3對應于TrGA酶的催化結構域，而說明書中僅提供了成熟蛋白的實驗數據，本領域技術人員無法得知僅催化結構域的變體是否能改善比活和/或熱穩定性。請請求人補充。
【請求人】：認可。淀粉結合結構域對酶的活性很重要（參考資料2-3可證明），丟失該區域后僅有催化結構域后是否具有效果無法預期。
【專利權人】：反證1能證明催化結構域能夠降解可溶性淀粉，其可單獨行使葡糖淀粉酶功能。參考資料2-3為優先權日之后的文件，不能用于證明相關內容。淀粉結合結構域對酶活是否有影響，與催化結構域是否具有酶活，是兩個獨立的問題。

【合議組】：根據前期雙方當事人的確認，請求人提出的涉及創造性的證據為證據1-6。 ;
【請求人】：認可。

【合議組】：請求人，確認無效請求共有11組證據組合方式，其中作為最接近的現有技術的證據為證據2、證據1和證據3。證據3和證據1為同族，其使用方式是否完全相同？
【請求人】：認可，相同。

【合議組】：請求人，請選擇最主要的具體結合方式進行比較分析。
【請求人】：證據2結合證據1,4或3。

【合議組】：確認無效請求理由中區別特征和解決的技術問題。
【請求人】：本專利的技術方案與證據2公開內容的區別技術特征在于葡糖淀粉酶的結構特征和功能特征，解決的技術問題在于改善親本或野生型葡糖淀粉酶的比活和/或熱穩定性。
【專利權人】：認可。

【合議組】：調查證據1和4分別公開了什么，得出什么啟示？
【請求人】：證據4公開了基于結構的序列比對，里氏木霉和泡盛曲霉的葡糖淀粉酶（即TrGA和AaGA）在結構上是同源的。此外，還公開了AaGA的催化結構域中由5個保守的區段限定了活性部位，并直觀地圖示了所述活性部位以及周圍的殘基，其中包括殘基Y48、W52、R54、D55。
證據1也教導了活性位點鄰近的區域是可用于增強比活和/或熱穩定性的區域，I43便位于活性位點鄰近的區域，還教導對黑曲霉葡糖淀粉酶（AnGA）的特別優選的位點D44突變可用于改善比活和/或熱穩定性。
【專利權人】：證據4的圖2涉及各個淀粉酶的比對，其比對的序列僅為全長序列的一小部分，其不能反映里氏木霉葡糖淀粉酶TrGA與黑曲霉葡糖淀粉酶AnGA或泡盛曲霉葡糖淀粉酶AaGA之間的結構關系，且上述序列并不涉及I43殘基。反證6表明AnGA所來源的黑曲霉與TrGA來源的里氏木霉在分類學上屬不同的綱，親緣關系遠。它們的全長序列以及催化結構域序列同一性很低（可見附件2的比對結果），本領域技術人員不會有動機將其結合。即使知道三維結構，也不清楚殘基取代對結構和活性的影響。

【專利權人】：當庭提交一份公知常識性證據。
【合議組】：請求人對公知常識性證據發表意見。
【請求人】：真實性無異議。
【專利權人】：公知常識性證據指出，即使知道三維結構，也不清楚殘基取代對結構和活性的影響，更何況恰恰是專利權人首次表征了TrGA的三維結構。

【合議組】：請求人曾做過各個酶的序列比對，全長還是片段？如果是片段，是哪個片段？
【請求人】：催化區域的比對。

【合議組】：歸納焦點問題之一：為了得到性能改善的酶變體，本領域技術人員是否有動機將催化區片段進行比對來進行改善？
【請求人】：黑曲霉和里氏木霉葡糖淀粉酶都屬于葡糖淀粉酶，具有相同的功能，然后再分析同源性和同一性，所以才進行相應的推理。相應的啟示在于：二者功能相同，且由證據4可知二者具有結構同源性。即便證據4僅顯示部分序列，但不影響本領域多種葡糖淀粉酶共享共有的構架。
【專利權人】：證據4的總體分析僅依據了葡糖淀粉酶的部分片段，因此請求人的推理均是后見之明。

【合議組】：反證6證明了黑曲霉和里氏木霉的親緣關系較遠，序列比對的圖中，證據4中并沒有I43位點。請發表意見。
【請求人】：反證6是網頁證據，其內容不采信。親緣關系遠不代表酶的結構同源性，參考文獻1可證明。說明書中在涉及同源性的定義中記載可具有45%的同源性，而經比對二者的同源性有44%，與說明書記載的接近。通過催化結構域的比對，可發現I43位的對應位點。
【專利權人】：證據1本身也證明其最多認可的同源性是60%，而黑曲霉和里氏木霉葡糖淀粉酶即便是催化結構域的同源性也只是56%，本領域認為該同源性是很低的。反證6證明的事實是公知常識，是本領域技術人員所能認同的。葡糖淀粉酶家族中的酶雖然三維結構類似，但其活性可能完全不同。

【合議組】：證據4中有沒有表明三維結構中的具體哪個螺旋對催化活性的關聯性？
【請求人】：沒有記載。但證據4圖中顯示，Y48、W52、R54、D55是活性部位的關鍵殘基，但沒有包含43位位點，只是鄰近。

【合議組】：證據4中羅列的位點是否有規律？或對應于哪個區域？
【請求人】：位于保守區內。

【合議組】：證據1中關于黑曲霉的D44位對應于里氏木霉的I43位，如何有啟示？證據1中有多種預測方法，有何意見？
【專利權人】：證據1通過計算機預測羅列了多達271多個位點，而對于D44位取代沒有任何說明。如果沒有本專利公開的I43，本領域技術人員沒有動機注意到D44位，請求人是后見之明。證據1有三種預測方法，每種方法預測得到的結果都不一樣，無法準確判斷哪個位點的取代有性能改善。
【請求人】：證據1明確教導在鄰近區域進行突變，雖預測結果不同，但不影響對于D44位位點的啟示。盡管證據1給出多個位點，但不一定對每個位點進行篩選，而其已經明確啟示特別優選的位點是D44位位點。

【合議組】：證據2+4+3組合方式的理由和證據2+4+1是否相同？
【請求人】：相同。

【合議組】：歸納三組證據組合方式：
第一類：以證據2為最接近的現有技術，依據其它證據給出的技術啟示評價創造性：證據2+1/3+4；證據2+4+5；證據2+1+4+5；證據2+4+5+6；證據2+1/3+4+5+6；證據2+3+4+5。
第二類：以證據1/3為最接近的現有技術，依據其它證據給出的技術啟示評價創造性：證據1/3+2+4。
第三類：以證據2為最接近的現有技術，基于本專利說明書的實驗數據缺陷，并未實際解決發明所要解決的技術問題，由此評判創造性：證據2+公知常識。
對第一類發表意見，證據2公開的事實，區別特征和解決的技術問題與前面相同。重點評述未調查過的問題。
【請求人】：證據4結合啟示如前所述。證據5教導了泡盛曲霉AaGA催化腔內的Tyr48（Y48）、Trp52（W52）活性位點，與I43位位點鄰近。
證據2還公開了來自多種不同菌株的葡糖淀粉酶及其序列，來自H.gelatinosa的葡糖淀粉酶（GA107）具有比里氏木霉葡糖淀粉酶更高的比活，而二者同一性達90%，且在43位殘基存在差異，據此本領域技術人員容易想到第43位氨基酸殘基的差異會對酶的比活產生影響。
【專利權人】：證據5公開的疏水結合位點不是催化位點，反應底物結合的殘基。對于泡盛曲霉葡糖淀粉酶，催化殘基是179位和400位，并非48和52位，與對應于本專利I43位的D44位相距很遠。
關于證據2中公開的GA107，其與本專利成熟葡糖淀粉酶相比有61個氨基酸不同，無從判斷其比活的提高是由于哪一個(或哪些)位點差異導致的，本領域技術人員選擇I43位進行突變的可能性非常小，是后見之明。況且，GA107的43位是T，而本專利則不涉及將I43位突變為T。

【合議組】：證據5進行比對的序列對應酶的哪個位置？用什么方法比對？目的是什么？
【請求人】：非全長序列。用本領域常用的方法比對，用于分析葡糖淀粉酶結構。證據5說明泡盛曲霉和里氏木霉葡糖淀粉酶的同源性高，圖1標識出了保守區。

【合議組】：對證據1、3、6公開的事實發表意見。
【請求人】：三份證據作用一樣，均用于說明在I43所屬區域內進行突變會對活性帶來影響。證據6示出了不同葡糖淀粉酶的5個保守區段。如上所述證據4示出的Y48、W52、R54、D55（相應于TrGA的Y47、W51、R53、D54）以及TrGA中的I43均位于證據6所闡釋的保守區段內。
【專利權人】：證據6未涉及里氏木霉葡糖淀粉酶，無法獲得啟示。高度保守區并不一定就是催化區域，證據4-6均未公開保守區對催化活性的影響。

【合議組】：證據6確定保守區段的目的是什么？
【請求人】：分析不同葡糖淀粉酶的結構相似性，但未涉及酶的性能的改善。

【合議組】：雙方當事人進行審議庭辯論。
【請求人】：對于技術啟示的判斷思路，是基于序列的同源性和功能的一致性，再做進一步的結構和功能的分析來實現的。同前述意見。
【專利權人】：如果不考慮本專利，選擇出本專利中的43位位點沒有相應的技術啟示。同前述意見。

【合議組】：基于上述調查，雙方是否堅持上述答辯意見和書面意見？
【請求人】：堅持書面意見和當庭答辯的意見。
【專利權人】：堅持書面意見和當庭答辯的意見。

【合議組】：本次口頭審理結束，決定將以書面的形式寄達給雙方當事人。本次口頭審理圖文直播結束，感謝廣大網友的關注和支持。